人體胚胎干細胞研究計劃是如何進行的呢?一位高級編輯到威斯康星州訪問，特地找到了威斯康辛大學WiCell研究所“人類胚胎干細胞培養方法”培訓班的首席培訓師Daisy Manning，在那里上了一堂人體胚胎干細胞研究的入門課。

Manning在一間專為學生實習準備的實驗室里講授了這堂人體胚胎干細胞研究速成課。在這里學習過的學生已經達到230人。課程涵蓋所有關于培養干細胞的基礎知識，從準備鼠胚胎纖維原細胞培養基支持層，到冷凍人體胚胎干細胞等等，除了定向分化以外的每一個步驟。

Manning不僅鼓勵那些想在自己學校開始干細胞研究計劃的人們參加課程，還鼓勵所有符合條件的的研究者來這里上課：“我經常說的一句話就是，如果你在這里犯過一個錯誤，這是件好事，因為這樣一來等你回到自己的實驗室時，就不會再犯第二次了。”

1.抓緊時間、耐心等待

Manning告訴這位編輯：“我們讓學員們了解到人體胚胎干細胞研究不是個短期工作，即使實驗室中一切都已經就緒，那最少還要花費十六周時間才能完成從衍生鼠胚胎纖維原細胞到完全培養出大量人體胚胎干細胞然后進行冷凍。所以，整個細胞實驗過程在有完備實驗室的條件下也要花費四到六個月。”

2. 千萬不要購買商業性的鼠胚胎纖維原細胞

雖然能買到鼠胚胎纖維原細胞，但是WiCell研究所建議還是自己培養為妙。“從懷孕的母鼠體內能夠獲得12到15瓶，成本只有26美元。如果從商業市場購買的話，4瓶鼠胚胎纖維原細胞就要花掉50美元，也就是說用兩倍的價格只能得到六分之一的細胞。此外，買回來的根本就不知道是什么樣的鼠胚胎纖維原細胞。通常最多只能用到第五代細胞，因為之后這些細胞會大量死亡，有些供應商出售第三代或第四代的鼠胚胎纖維原細胞，這樣一來它們對于胚胎肝細胞培養來說根本毫無用處。”

3. 檢查輻射源

研究過程中，必須使用輻照來暫停生長。Manning 表示，WiCell研究所的規定要求輻照劑量應該為8000拉德(輻射劑量單位)，但這是一個變量。“因為我們在實驗發現，隨著輻照源的不同，輻照量也會變化，”她補充說。“對于銫輻照器來說，8000拉德正好，但是對于X射線來說，輻照量需要在12000拉德以上。”雖然這一過程可以使用絲裂霉素C來代替，但是Manning建議還是盡量使用輻照的方法。“胚胎干細胞對化學藥品十分敏感，”她解釋說。“當你用化學藥劑來鈍化鼠胚胎纖維原細胞時，一定要保證在加入胚胎干細胞前清除了所有的化學藥劑。”

4. 快速解凍!

Manning告訴這位編輯：“盡可能快地解凍細胞。這是因為我發現有幾次我和另一位學員解凍的細胞在幾乎同等條件下，她最后所得到的細胞團只有我的50%左右。雖然我們使用的時間只有30到45秒左右的差距，但是最后我們所取得的結果差別很大。”她建議，盡可能在實際解凍胚胎干細胞前按照要求操作幾次，這樣有助于減少浪費時間。

5. 兩周的等待

別想著在解凍后很快就會培養出大量的細胞，在這一過程中只有0.1% 到 1%的細胞能夠存活下來。Manning說：“我們一直告訴學員們每天都要注意它們的發展，因為細胞團隨時可能會出現，也許三、五天，甚至七、八天，突然之間你就會發現細胞團出現了。”解凍十四天后還沒有出現細胞團并不意味著實驗失敗，而且不要忽視外表組織的邊緣，她補充說。“因為很多時候這些部位會出現大量的細胞團。”(用手指放在外表組織的邊緣擋住光線衍射就能看到。)

6. 每天對細胞的培養

要每天觀察人體胚胎肝細胞的生長過程并添加養分。“而且永遠別讓它們過量生長，一般來說這些細胞每周會分裂一次。”人體胚胎干細胞的機構緊密、均勻而且邊緣清晰，而分化出的細胞團參差不齊、邊緣凌亂或者有透明的中心點。在低倍數的放大鏡下，健康的細胞團發白，而那些在溶液中發黃的細胞團類似發育中的胚胎很有可能會分化。

7.越多關注、越多收獲

經驗豐富的人體胚胎干細胞研究者一般都十分關注細胞的生長過程。“如果一個研究者關注細胞的生長，就會花費很多時間用顯微鏡觀察它們，而且會熟悉分化前這些細胞的外表特征。久而久之，他就能學會預測下一步細胞會產生什么樣的變化。” Manning補充說，因為人體胚胎肝細胞比其他科學研究更講究，所以很多東西在課堂上是無法傳授的，但是培訓課程能夠幫助學員學會如何做出正確的判斷。

8. 分化開始

ESC分化雖然會給細胞的培養帶來一些困難，但這也是件好事，它表明培養基很健康。如果培養基沒有出現任何問題，那么很有能已發生了什么問題。“當胚胎肝細胞突然生長的很快，很健康，而且從未分化過，那么你就該想想是否有什么地方出了問題，” Manning解釋說。

9.決定研究步驟

Manning 告訴這位編輯：“對于如何處理人體胚胎肝細胞培養板，我們有一條不成文的規定：那就是對于分化率為10%的培養板，我們不做任何處理;如果分化率在10%到50%之間，我們會用一種叫做‘挑選移除’的方法去掉分化了的細胞;如果分化率大于50%，用‘挑選保留’的方法借助機械將未分化的細胞團轉移到一個新的鼠胚胎纖維原細胞培養板上。”

10.避免“挑選保留”

Manning表示，如果一個研究者經常需要使用“挑選保留”的方法的話，那么他的操作可能有問題。“一般來說培養過程中每隔一代就要做一次挑選移除工作，這個時間段或許有小許誤差，而且絕對不能打斷分化過程。如果每隔一個月或每三個月就要做一次挑選保留工作的話，就有問題了。”

11. 別做完美主義者

Manning告誡這位編輯說，過于頻繁的挑揀會導致異常細胞出現，所以千萬別做完美主義者。她補充說，也許研究者會看到培養板上有2%或3%的分化部分，那并不算什么，而且這些細胞團完全正常，但是如果每個月研究者都不停地進行挑揀，讓培養基上完全沒有分化的部分，那么很有后可能會導致產生諸如三體型12或17這樣的異常現象。“所以不要過于熱切。

12. 千萬別用抗生素

“我們發現如果細胞培養方法和消毒手段都很完善，那么根本沒有必要使用抗生素，” Manning說。此外，它們會嚴重地損害培養基。“你不知道在加入了另外一種成分后，它對胚胎肝細胞會產生什么樣的影響。這些抗生素可能會導致異常細胞的產生。”

13. 別忘了染色體組型

WiCell研究院對第二十代和二十五代細胞進行染色體分類，這樣來保證它們擁有正常基因。Manning說：“我們建議研究者在開始實驗前就進行染色體分類，這樣能夠保證它們都處于正常狀態。然后，在開始收集、發表大量數據時，一定要再次進行檢查，而且我們認為在第五十代以后，每十代就要進行一次染色體分類。”

14.及早、經常冷凍細胞

Manning說，在解凍后盡快積累一些備用冷凍胚胎細胞，一旦研究者開始冷凍后，總是希望盡快完成這一過程，因為這樣才能將傳代細胞的數量降到最低。千萬別等到細胞越來越多的時候才開始冷凍過程。細胞在能夠分裂的前兩天就應該冷凍起來，而到了第五天它們的生長最快，也最需要快速解凍。

15.這是一份全職工作

Manning強調說，人體胚胎細胞培養實際上并不清閑。培養鼠胚胎纖維原細胞與分裂培養人體胚胎細胞的過程就需要每周20小時以上的時間。這樣，研究者就必須訓練一個助手在自己生病或休假的時候來培養細胞。“一個人單獨做這份工作實在是太費心了，所以一定要找個幫手，”她說。